Negli ultimi anni abbiamo sentito più volte parlare di CRISPR/Cas9, la tecnica messa a punto da Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, ispirata al sistema immunitario dei batteri.

I batteri, infatti, hanno delle serie di sequenze nel loro DNA che copiano il genoma dai virus a cui sono esposti e servono come memoria immunitaria, un po’ come i nostri anticorpi sono in grado di riconoscere i patogeni alla seconda esposizione e per questo non possiamo ammalarci due volte di morbillo o rosolia, per esempio.

Nel nostro caso gli anticorpi legano la superficie del patogeno e gli impediscono l’infezione, nel caso del sistema CRISPR/Cas, invece, i batteri usano un sistema di endonucleasi, ovvero di forbici molecolari, per tagliare il DNA o l’RNA degli invasori, che sono i batteriofagi, cioè virus che infettano i batteri.

La rivoluzione introdotta da CRISPR nella frontiera delle modificazioni genetiche è stata l’intuizione originale dei due gruppi di ricerca di riadattare il sistema batterico a una tecnica di editing genetico veramente semplice da applicare.

CRISPR/Cas9 è il primo della famiglia a essere stato compreso e di cui è stato intuito il potenziale. Se inseriamo nelle cellule Cas9 e un segmento di RNA con sequenza identica al nostro gene di interesse, l’enzima attiverà la sua funzione di forbice molecolare ed andrà a tagliare il DNA in corrispondenza del gene causando una rottura su entrambi i filamenti della doppia elica. Il nostro DNA non è capace di riparare questi tagli senza aggiungere delle mutazioni, che hanno come conseguenza l’interruzione della sequenza funzionale del gene. Questo è diventato il sistema più usato, in quanto di più facile applicazione e maggiore utilità,  in tutti i laboratori di biologia molecolare del mondo per inattivare geni, modo indiretto per comprendere la loro funzione o il loro coinvolgimento in determinate patologie.

Inoltre, se in seguito al taglio si aggiunge una sequenza a doppio filamento precedentemente sintetizzata in vitro, questa può essere integrata all’interno del DNA.

La sostituzione di porzioni di DNA mutate con sequenze corrette ha come ricaduta la possibilità di curare malattie genetiche con possibili modifiche dell’embrione, come è già stato sperimentato in un primo importante lavoro, pubblicato su Nature, per la correzione di cardiomiopatia ipertrofica (ne abbiamo parlato qui).

I limiti sono ancora molti, da una parte ci sono problemi etici, che  necessitano di definire quali geni è consentito modificare in un embrione, per evitare che si arrivi all’estremo di avere solo figli alti biondi e con gli occhi azzurri (per fare un esempio), dall’altro l’enzima va ancora ottimizzato per non avere degli off target effects, ovvero per fare in modo che solo il gene bersaglio venga inattivato e non anche dei geni con sequenze simili. A questo proposito è stato recentemente pubblicato uno studio su Nature Biotechnology dell’Università di Trento in cui sono stati selezionati enzimi con un maggiore grado di fedeltà e minori off target. Inoltre recenti studi hanno messo in luce una correlazione tra CRISPR e cellule cancerose, in particolare è stato osservato che p53, un regolatore del ciclo cellulare e guardiano del nostro genoma puö interferire con il funzionamento di CRISPR/Cas9 in cellule sane, mentre non è attivo in cellule cancerose in cui molto spesso p53 è mutato consentendo una crescita aberrante..

Più recentemente, il gruppo guidato da Jennifer Doudna e un gruppo del Broad Institute di Cambridge (USA) si sono interessati ad altri cas della famiglia, ovvero ad altri enzimi del sistema immunitario batterico. In particolare hanno identificato importanti caratteristiche degli enzimi Cas12a e Cas13 che sono dotati di abilità diverse rispetto a Cas9. Infatti, in seguito alla copia del segmento di RNA derivante dal virus sono in grado, il primo di tagliare tutte le sequenze a singolo filamento di DNA che trovano, il secondo tutte le sequenze di RNA che trovano. Nuovamente l’abilità dei due gruppi è stata comprendere come riadattare questo meccanismo per applicazioni utili all’umanità in questo caso nell’ambito della diagnostica.

I sistemi sviluppati si basano sull’analisi di campioni di pazienti come ad esempio sangue, saliva o altri fluidi biologici, inserendo Cas12a o Cas13 nel sistema e un singolo filamento di RNA o DNA legato a un fluoroforo. Se nel campione è presente il virus di interesse, l’enzima si attiva e taglia anche il segmento introdotto, causando la liberazione del fluoroforo e la conseguente emissione di luce. Sarà quindi sufficiente misurare l’emissione di luce per verificare la presenza del patogeno nel campione. Il sistema si è dimostrato estremamente efficace nell’identificazione di quantità di DNA o RNA virale nell’ordine dell’attomolarità (10-18 moli),  riconoscendo ad esempio papillomavirus in tamponi vaginali o Dengue e Zika nel sangue, un risultato che oggi è ottenibile solo con tecniche che sfruttano reagenti e macchinari molto più costosi e richiedono più tempo.

I due gruppi stanno ora lavorando per mettere a punto, a partire da questo sistema, un equivalente diagnostico di un test di gravidanza, in cui se si è infetti appare una linea sul dispositivo. Un test rapido e affidabile che non necessita di particolari tecnologie o elettricità per dare un risultato è di estrema importanza, ad esempio, in contesti rurali africani, dove avere metodi rapidi ed efficaci di diagnosi può consentire un rapido inizio di un trattamento.

Non ci resta che attendere alcuni anni affinché il sistema CRISPR/Cas diventi un sistema largamente utilizzato nella correzione di malattie genetiche e in diagnostica. Con magari qualche futura sorpresa legata a nuove applicazioni di altri enzimi della famiglia. Nel mentre, probabilmente arriverà nei prossimi anni un Nobel per le scopritrici della tecnica e resterà il fatto che i ricercatori di tutto il mondo saranno grati per avere finalmente a disposizione un sistema veloce ed efficace di editing genetico.

Per approfondimenti e altri punti di vista potete ascoltare puntate del podcast o leggere pezzi del blog in cui ne abbiamo già parlato:

https://www.scientificast.it/2018/06/11/crispr-and-cars/
https://www.scientificast.it/2017/08/14/atletica-microchip-infradito-scientificast-166/
https://www.scientificast.it/2017/03/06/crispr-suoi-scenari-scientificast-145/
https://www.scientificast.it/2015/11/19/genome-editing-e-i-nuovi-ogm/

FONTI

https://www.youtube.com/watch?v=22F85FOAyik
http://science.sciencemag.org/content/early/2018/02/14/science.aar6245
http://science.sciencemag.org/content/early/2018/02/14/science.aaq0179
https://www.nature.com/articles/nbt.4066
https://www.nature.com/articles/s41591-018-0049-z

Immagine di copertina: WhiteDragon via Shutterstock

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